очистка белков

Очистка белков - комплекс методов направленных на получение чистого препарата определенного белка из сложной смеси, такой как клеточный экстракт. Разделить различные белки возможно на основе различий в их свойствах таких как молекулярная масса, размер молекул, специфичность связывания с определенными веществами, а также растворимость, заряд, которые зависят от температуры, pH, ионной силы раствора и других факторов. Очистка белков необходимо как для изучения их свойств и функций, так и для использования в промышленности, медицине и лабораторной практике.
Источником для выделения и очистки белков преимущественно служат образцы тканей или биомасса культивируемых клеток. Первым этапом очистки белков является приготовление лизатов или клеточных экстрактов путем разрушения плазматических мембран клеток, а в случае животных клеток, еще и клеточных стенок. После этого лизаты могут подлежать дифференциального центрифугирования, которое позволяет получить препараты обогащены необходимыми субклеточном фракциями (например, ядрами, митохондриями, микросомами т.д.). Для концентрации и фракционирования белков может быть использовано высаливания, избавиться от низкомолекулярных примесей можно с помощью диализа. Окончательная очистка происходит применением различных видов хроматографии, гель-электрофореза, изоэлектрической фокусировки или их комбинации.
Содержание
1 История
2 Источник белка
3 Перевод белков в раствор
4 Стабилизация белков
5 Методы разделения
6 Примечания
7 Источники
История
В двадцатых годов XX века природа белковых молекул оставалась довольно загадочной. Их большую молекулярную массу объясняли коллоидной агрегацией меньших, и неизвестных, молекул. Это представление изменилось, когда Джеймсу Самнеру в 1926 году удалось кристаллизовать фермент уреазу. После этого стало понятно, что выделение отдельных белков не является невозможной задачей. Первые методики были очень грубыми по современным меркам. Для того чтобы получить препарат определенного белка удовлетворительного качества нередко уходило несколько лет и огромные количества исходного материала. Несмотря на сложность процесса до 1940-х годов около 20 белков были получены в чистой форме.
Методы очистки белков постоянно совершенствуются и позволяют получать все чистые препараты в большем количестве и за меньшее время. С помощью современных методик можно разделить белки насколько похожи по свойствам, что еще несколько лет назад считались одной чистым веществом [1].
Источник белка
Культура рекомбинантных бактрим
Белки составляют значительную долю сухой массы всех живых организмов, однако концентрация каждого конкретного белка может существенно отличаться, например, гемоглобин значительно превосходит по содержанию все другие соединения в эритроцитах, в то время как на одну клетку кишечной палочки может быть всего несколько молекул lac-репрессора. Обычно один и тот же белок можно выделить из различных источников, в частности, много ферментов метаболизма общие для всех форм жизни. Однако свойства белков полученных из разных организмов, а также из разных тканей одного организма, могут отличаться между собой. Обычно в выборе источника для выделения и очистки белка руководствуются такими критериями как легкость получения нужной ткани (клеток) в достаточном количестве, концентрация желаемой соединения в ней, а также критериям специфическими для каждого белка, которые могут улучшить изоляцию и стабилизацию. Чаще всего используют ткани домашних (свиней, коров, кур) или лабораторных (крысы) животных, а также культуры микроорганизмов, таких как кишечная палочка (Escherichia coli) и пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae). Однако с развитием и распространением методов молекулярного клонирования белки все чаще получают из микроорганизмов-надпродуцентив, которым было введено желаемый ген. В таком случае клонированный белок может составлять около 30% всех белков напродуцента, что значительно облегчает его выделения и очистки [2].
Перевод белков в раствор
Стеклянные гомогенизаторы Дунса с тефлоновыми пистонами
После выбора источника белка первым этапом очистки является перевод его в раствор, этот шаг нужен в случае выделения белков из биологических жидкостей, таких как плазма крови. Существует много методов разрушения оболочек клеток для высвобождения цитозоля, и выбор одного из них зависит от механических свойств источника белка а также его локализации.
Самый простой и самый мягкий метод перевода белков цитозоля в раствор - осмотическое лизування. При этом клетки помещают в гипотонический среду, где, вследствие осмотических явлений, они набухают и лопаются. Такой метод можно использовать для животных клеток, которые не имеют клеточной стенки, однако для растительных, бактериальных и грибных он преимущественно неэффективен. Клеточную стенку бактерий часто разрушают ферментом лизоцимом, также методом соникации (обработкой ультразвуком). В растворах для лизування часто используют детергенты (Triton X-100, Tergitol NP-40 и т.п.) или органические растворители (ацетон, толуол), но это допустимо только в тех случаях, когда такие вещества не приведут к денатурации желаемого белка.
Образцы клеток и тканей также могут гомогенизировать используя циклы замораживания / таяния, растирания с песком или стеклянными шариками, высокоскоростные блендеры, гомогенизаторы (состоят из рукава и плотно прилегающие пистона из стекла или тефлона, бывают механические и ручные), френч-прессы для культуры клеток (Клетки разрушаются путем протискання сквозь небольшое отверстие под высоким давлением).
Полученный лизат фильтруют или центрифугируют для осаждения крупных обломков клеток. Если желаемый белок локализуется не у цитозоле, а в какой субклеточном фракции, например плазматической мембране, ядре или митохондриях, то его очистки включает выделение этой фракции путем дифференциального центрифугирования: сначала осаждают тяжелее компоненты клетки, затем отбирают супернатант и центрифугируют при такой скорости, при которой в осадок переходит необходима фракция. Мембранные белки отделяют от липидов с помощью детергентов или органических растворителей [2].
Стабилизация белков
После того как белок устранили с естественных для него условиях, он может быть разрушенным в результате воздействия многих факторов. В частности, белки денатурируют при изменении значения pH, поэтому растворы для лизування и последующих стадий очистки содержат буферные системы, поддерживающие водородный показатель в том диапазоне, в котором необходимые молекулы оставаться стабильными.
Большинство белков подлежит медленной денатурации при температуре более 25 ° C . Поэтому все процедуры с ними чаще всего выполняют при охлаждении до 0-4 ° C (на льду). Некоторые белки сохраняют стабильность вне живых клеток только при температуре ниже чем -100 ° C. С другой стороны, существуют также и холодочутливи белки, которые нельзя переохладить.
При лизування клеток из них высвобождаются протеазы - ферменты, гидролизуют белки. Они могут стать причиной деградации нужного белка. И хотя в клеточных экстрактах поддерживают pH, при котором такие ферменты неактивны, в них также преимущественно используют химические ингибиторы протеаз, такие как PMSF. Другой потенциальной причиной деградации белков могут стать микроорганизмы, поэтому во время длительного хранения к растворам белков добавляют небольшое количество токсичных соединений, которые не влияют на структуру самих белков, например, азида натрия.
Многие белки могут быть нестабильными на границе раздела жидкость-воздух и при низких концентрациях значительная часть их молекул теряется вследствие сорбции к поверхностям. Поэтому при выделении белков стараются избегать образования пены и пузырьков, а растворы сохраняют концентрированными.
Если нужен белок отличается особой устойчивостью к каким из перечисленных факторов, способных разрушить другие белки, это его свойство можно использовать для очистки. Например, если он очень термостойким, то клеточный экстракт нагревают до высокой температуры на короткий промежуток времени, в результате чего большинство примесей денатурирует и оседает, а необходимый белок остается невредимым. Белки резистентные к действию протеаз можно выделять, используя автолиз клеток, то есть поддерживать лизат в условиях, при которых протеалитични ферменты являются активными и разрушают большинство других клеточных белков [3].
Методы разделения
Свойство, на основе которой происходит разделение
Методы
Растворимость
Высаливание
Вслоювання
Заряд в ионизированной форме
Ионообменная хроматография
электрофорез
изоэлектрическая фокусировки
Полярность
Адсорбционная хроматография
хроматография на бумаге
Оберненофазна хроматография
Гидрофобная х роматография
Размер молекул
Диализ и ультрафильтрация
Гель-электрофорез
гельфильтрации
Ультрацентрифугирование
Специфичность связывания
аффинной хроматографии
Для разделения белков могут использоваться различия в их свойствах , такие как заряд в ионизированной форме, растворимость, молекулярная масса, полярность, способность специфически связываться с определенными соединениями.
Примечания
↑ Voet et al, 2011, с. 132
↑ а б Voet et al, 2011, с. 130
↑ Voet et al, 2011, с. 130-131
Источники
Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L (2007). Biochemistry (изд. 6th). W.H. Freeman and Company. с. 67-75. ISBN 0-7167-8724-5.
Nelson D.L., Cox M.M. (2008). Lehninger Principles of Biochemistry (изд. 5th). W. H. Freeman. с. 85-92. ISBN 978-0-7167-7108-1.
Voet D., Voet J.G. (2011). Biochemistry (изд. 4th). Wiley. с. 129-156. ISBN 978-0470-57095-1.


Очищення білків

Випадкові Статті

Apollonias zeylanica

Apollonias zeylanica

Apollonias zeylanica — це вид квіткових рослин роду Аполонії родини Лаврових Зміст 1 Морфо...
Підрозділ (значення)

Підрозділ (значення)

Підрозділ: Підрозділ військова справа Команда Департамент підрозділ Підрозділ — поняття, яке ма...
Звіробій (фільм, 1990)

Звіробій (фільм, 1990)

«Звіробі́й» — художній фільм у двох серіях 1990 за мотивами однойменного роману Дж Ф Купера ...
Ольденборстель

Ольденборстель

Ольденборстель нім Oldenborstel — громада в Німеччині, розташована в землі Шлезвіг-Гольштейн Вх...