Ақуыздарды тазарту

Ақуыздарды тазарту - бұл белгілі бір ақуызды жасуша сығындысы сияқты күрделі қоспадан таза дайындауға бағытталған әдістер кешені. Молекулалық массасы, молекулалардың мөлшері, белгілі бір заттармен байланысу ерекшелігі, сондай-ақ температура, рН, ерітіндінің иондық күші және басқа факторларға тәуелді әр түрлі белоктарды бөлуге болады. Ақуыздарды тазарту олардың қасиеттері мен функцияларын зерттеу үшін, сонымен қатар өнеркәсіпте, медицинада және зертханалық практикада қолдану үшін қажет.Тіндердің немесе мәдени дақылдардың биомассаларының үлгілері ақуыздарды оқшаулау және тазарту көзі болып табылады. Ақуыздарды тазартудың бірінші кезеңі - лизаттарды немесе жасуша сығындыларын жасушалардың плазмалық мембраналарын бұзу арқылы дайындау, ал жануарлар жасушалары болмаған жағдайда, сонымен қатар жасуша қабырғалары. Содан кейін лизаттарды дифференциалды центрифугалауға ұшыратуға болады, бұл дайындықты қалаған жасушалық фракцияларға байытуға мүмкіндік береді (мысалы, ядролар, митохондрия, микросомалар және т.б.). Ақуыздардың концентрациясы мен фракциялануы үшін тұздануды, ал төмен молекулалық қоспаларды диализ көмегімен жоюға болады. Ақырғы тазарту әр түрлі хроматография, гель электрофорезі, изоэлектрлік фокустау немесе осы комбинацияны қолдану арқылы жүзеге асырылады. Мазмұны
1 Тарих
2 Протеин көзі
3 Ақуыз ерітіндіге ауысады
4 Протеинді тұрақтандыру
5 Бөлу әдісі
6 Ескерту: 7 дереккөздер
Тарих - 1920 жылдарға дейін ақуыз молекулаларының табиғаты өте құпия болып қала берді. Олардың үлкен молекулалық массасы ұсақ және белгісіз молекулалардың коллоидтық агрегациясымен түсіндірілді. Джеймс Сумнер 1926 жылы уреаз ферментін кристалдандырған кезде бұл идея өзгерді. Осыдан кейін жеке ақуыздарды оқшаулау мүмкін емес міндет емес екені белгілі болды. Алғашқы техникалар заманауи стандарттарға сәйкес келмеді. Қанағаттанарлық сападағы белгілі бір ақуызды алу үшін бірнеше жыл және үлкен мөлшерде бастапқы материалдар сирек жұмсалды. Процестің күрделілігіне қарамастан, 1940 жылдарға дейін таза түрде 20-ға жуық ақуыз алынды. Заманауи әдістерді қолдану арқылы біз бірнеше жыл бұрынғы қасиеттері бойынша ақуыздарды бір таза зат ретінде бөліп аламыз [1]. Протеин көзі - рекомбинантты бактериялардың культурасы
Ақуыздар барлық тірі организмдердің құрғақ массасының едәуір бөлігін құрайды, алайда әр жеке ақуыздың концентрациясы едәуір өзгеше болуы мүмкін, мысалы, гемоглобин эритроциттердегі барлық басқа қосылыстардан едәуір жоғары, ал Escherichia coli клеткасында бірнеше лак репрессорлы молекулалар болуы мүмкін. Әдетте бірдей ақуызды әртүрлі көздерден оқшаулауға болады, атап айтқанда көптеген метаболизм ферменттері өмірдің барлық формаларына тән. Алайда әртүрлі ағзалардан, сондай-ақ бір организмнің әртүрлі тіндерінен алынған ақуыздардың қасиеттері әртүрлі болуы мүмкін. Әдетте ақуызды оқшаулау және тазарту көздерін таңдау қажетті тіндерді (жасушаларды) жеткілікті мөлшерде алудың жеңілдігі, ондағы қажетті қосылыстың концентрациясы, сондай-ақ оның оқшаулануы мен тұрақталуын жақсартатын әрбір ақуызға тән өлшемдер сияқты өлшемдерді басшылыққа алады. Көбінесе үй жануарлары (шошқа, сиыр, тауық) немесе зертханалық (егеуқұйрық) жануарлардың тіндері, сонымен қатар Escherichia coli және наубайхананың ашытқысы (Saccharomyces cerevisiae) сияқты микроорганизмдердің дақылдары қолданылады. Алайда, молекулалық клондау әдістерінің дамуы мен көбеюімен ақуыздар көбінесе қажетті ген шығарған микроорганизмдерден алынады. Бұл жағдайда клондалған ақуыз барлық ақуыздың жанама өнімінің шамамен 30% құрайды, бұл оның оқшаулануын және тазартылуын едәуір жеңілдетеді [2] Протеиндердің ерітіндіге конверсиялануы
Duns шыны гомогенизаторларын тефлон поршендерімен ... Бірінші кезеңде ақуыз көзін таңдағаннан кейін тазарту - бұл оны ерітіндіге беру, ақуыздарды қан плазмасы сияқты биологиялық сұйықтықтардан бөлген жағдайда бұл қадам қажет емес. Цитозолды шығару үшін жасуша мембраналарын бұзудың көптеген әдістері бар және олардың бірін таңдау ақуыз көзінің механикалық қасиеттеріне, сондай-ақ оның локализациясына байланысты.Цитозол ақуыздарын ерітіндіге ауыстырудың қарапайым және қарапайым әдісі - осмотикалық лизис. Жасушалар гипотониялық ортаға орналастырылады, онда осмотикалық құбылыстардың әсерінен олар ісіп, жарылып кетеді. Бұл әдісті жасуша қабырғасы жоқ жануарлар жасушаларына қолдануға болады, бірақ өсімдік, бактериалды және саңырауқұлақтар үшін көбінесе тиімсіз. Бактериялардың жасушалық қабырғасы көбінесе лизоцим ферментімен, сондай-ақ ультрадыбыспен (ультрадыбыспен) бұзылады. Жуғыш заттар (Triton X-100, Tergitol NP-40 және т.б.) немесе органикалық еріткіштер (ацетон, толуол) көбінесе лизис ерітінділерінде қолданылады, бірақ мұндай заттар қажетті ақуызды қабылдамайтын жағдайда ғана рұқсат етіледі.
Үлгілер жасушалар мен тіндерді мұздату / еріту циклдарын қолдана отырып, құммен немесе шыны шарлармен тегістеу арқылы, жоғары жылдамдықты араластырғыштармен, гомогенизаторлармен (бір-бірімен жеңдерден және тығыз бекітілген шыныдан немесе тефлон поршеньдерінен тұратын, механикалық және қолмен басылатын) біртектес болады (жасушалар кішкентай, жоғары қысымды тесік арқылы басу арқылы жойылады).
Алынған лизат жасушалардың үлкен фрагменттерін сақтау үшін сүзіледі немесе центрифугаланады. Егер қалаған ақуыз цитозолда локализацияланбаған болса, бірақ плазмалық мембрана, ядро ​​немесе митохондрия сияқты кейбір жасуша бөлшектерінде болса, онда оны тазарту дифференциалды центрифугалау арқылы осы фракцияны оқшаулауды қамтиды: алдымен ауыр клетканың компоненттері тұнбаға түседі, содан кейін супернатант таңдалады және центрифугаланады. қажетті фракция тұнбаға түседі. Мембраналық ақуыздар липидтерден жуғыш заттармен немесе органикалық еріткіштермен бөлінеді [2] Протеинді тұрақтандыру - Ақуыз табиғи жағдайдан шығарылғаннан кейін оны көптеген факторлармен жоюға болады. Атап айтқанда, рН өзгерген кезде ақуыздар денатурацияға ұшырайды, сондықтан лизис ерітінділері мен кейінгі тазарту қадамдарында қажетті молекулалар тұрақты болатын диапазонда сутегі индексін ұстап тұратын буферлік жүйелер болады.
Ақуыздардың көпшілігі 25 ° C-тан жоғары температурада баяу денатурацияға ұшырайды. . Осыған байланысты олармен барлық процедуралар көбінесе 0-4 ° C (мұзда) салқындаған кезде жасалады. Кейбір ақуыздар тірі жасушалардан тыс тұрақтылықты тек °100 ° C-тан төмен температурада сақтайды. Екінші жағынан, салқындауға болмайтын суыққа сезімтал ақуыздар да бар. Жасуша лизисі кезінде белоктарды гидролиздейтін ферменттер түзіледі. Олар қажетті ақуыздың тозуын тудыруы мүмкін. Жасуша сығындылары мұндай ферменттер белсенді емес рН-ны ұстап тұрғанымен, PMSF сияқты химиялық протеаза ингибиторларын қолданған жөн. Ақуыз деградациясының тағы бір себебі микроорганизмдер болуы мүмкін, сондықтан ұзақ уақыт сақтау кезінде ақуыз ерітінділеріне аз мөлшерде уытты қосылыстар қосылады, олар натрий азиді сияқты белоктардың өздеріне құрылымына әсер етпейді.Көптеген ақуыздар сұйық ауа интерфейсінде тұрақсыз болуы мүмкін. , ал төмен концентрацияда олардың молекулаларының көп бөлігі беттерді сорбциялау нәтижесінде жоғалады. Осыған байланысты белоктарды бөлу кезінде олар көбік пен көпіршіктердің пайда болуына жол бермеуге тырысады және ерітінділерді шоғырланған күйде сақтайды.
Егер қажет ақуыз басқа ақуыздарды жоюға болатын келесі факторлардың кез-келгеніне өте төзімді болса, онда бұл қасиетті тазарту үшін пайдалануға болады. Мәселен, егер ол өте ыстыққа төзімді болса, жасуша сығындысы қысқа уақыт ішінде жоғары температураға дейін қызады, нәтижесінде алынған қоспалардың көп бөлігі денатурацияға түседі және жиналады, ал қалаған ақуыз өзгеріссіз қалады. Протеазға төзімді ақуыздарды жасушалық автолиз көмегімен оқшаулауға болады, яғни протеолитикалық ферменттер белсенді болған жағдайда лизатты ұстап, басқа да жасушалық ақуыздарды бұзады. [3]
Бөлу әдістері
br> Әдістері - Ерігіштік - Тұздау - Қабаттау - Иондалған күйдегі зарядтау - Ион алмасу хроматографиясы - Электрофорез - Изоэлектрлік фокус - Полярлық - Адсорбция хроматографиясы
Хроматография қағаздар
Кері фазалы хроматография
Гидрофобты х Роматография
Молекуланың мөлшері - Диализ және ультрафильтрация - Гельді электрофорез - Гельді сүзу - Ультрацентрифугалау - байланыстырушы ерекшелігі - Салыстырмалы хроматография
Ақуыздарды бөлу үшін олардың қасиеттеріндегі айырмашылықтарды қолдануға болады мысалы, иондалған күйдегі заряд, ерігіштігі, молекулалық массасы, полярлығы, белгілі бір қосылыстарға ерекше байланыстыру қабілеті.
Ескертпелер
↑ Воэт соавт, 2011, б. 132
Vo a b Voet соавт, 2011, б. 130
↑ Воэт және басқалар, 2011, б. 130-131 - дереккөздер - Берг Дж.М., Тимоцко Ж.Л., Стрейтер Л (2007). Биохимия (6 том). В.Х. Фримен және Компания. б. 67—75. ISBN 0-7167-8724-5.
Нельсон Д.Л., Кокс М.М. (2008). Леннингердің биохимия негіздері (5 том). W. H. Freeman. б. 85—92. ISBN 978-0-7167-7108-1.
Voet D., Voet J.G. (2011). Биохимия (4 том). Wiley. б. 129—156. ISBN 978-0470-57095-1.


Очищення білків

Випадкові Статті

Гродненське воєводство

Гродненське воєводство

Гро́дненське воєводство — історична адміністративно-територіальна одиниця у складі Великого кня...
Василівка (Любашівський район)

Василівка (Любашівський район)

Васи́лівка — село в Україні, в Любашівському районі Одеської області. Населення становить 112 о...
Третя ступінь

Третя ступінь

Долорес Костелло Луїз Дрессер Оператор Хел Мор Монтаж Кларенс Колстер Кінокомпанія Warner Bros...
Намо

Намо

Намо — один з районів лаос ເມືອງ муанг провінції Удомсай, Лаос1 Приміткиред ↑ Maplandia wor...