Ачыстка бялком

Ачыстка бялку - гэта комплекс метадаў, накіраваных на атрыманне чыстага прэпарата канкрэтнага бялку са складанай сумесі, напрыклад клеткавага экстракта. Можна аддзяляць розныя вавёркі на аснове адрозненняў у іх уласцівасцях, такіх як малекулярная маса, памер малекул, спецыфічнасць звязвання з пэўнымі рэчывамі, а таксама растваральнасць, зарада, якія залежаць ад тэмпературы, рн, іённай сілы раствора і іншых фактараў. Ачыстка бялку неабходная як для вывучэння іх уласцівасцей і функцый, так і для выкарыстання ў прамысловасці, медыцыне і лабараторнай практыцы, Узоры тканін або біямасы культурных клетак служаць крыніцай для выдзялення і ачысткі бялкоў. Першы этап ачысткі бялку - гэта падрыхтоўка лізатаў або клеткавых экстрактаў, разбураючы плазматычныя мембраны клетак, а ў выпадку не з клеткамі жывёл, а таксама клеткавымі сценкамі. Затым лізаты могуць быць падвергнуты дыферэнцыяльнай цэнтрабежцы, што дазваляе ўзбагаціць прэпарат патрэбнымі субклеточными фракцыямі (напрыклад, ядрамі, мітахондрыямі, мікрасомамі і г.д.). Для канцэнтрацыі і фракцыянавання бялкоў можна выкарыстоўваць саленне, а таксама можна пазбавіцца ад нізкамалекулярных прымешак шляхам дыялізу. Канчатковае ачышчэнне ажыццяўляецца пры дапамозе розных відаў храматаграфіі, гель-электрафарэзу, ізаэлектрычнага факусавання альбо іх камбінацыі.
Змест - 1 Гісторыя
2 Крыніца бялку
3 Канверсія бялку
4 Стабілізацыя бялку
5 Спосабы падзелу - 6 Нататкі - 7 Крыніцы - Гісторыя - Да 1920-х гадоў характар бялковых малекул заставаўся даволі загадкавым. Іх вялікая малекулярная маса тлумачылася калоіднай агрэгацыяй меншых і невядомых малекул. Гэтая ідэя змянілася, калі Джэймсу Самнеру ўдалося крышталізаваць фермент урэазы ў 1926 годзе. Пасля гэтага высветлілася, што вылучэнне асобных бялкоў - невыканальная задача. Першыя метады былі вельмі грубымі па сучасных мерках. Каб атрымаць прэпарат з пэўнага бялку здавальняючай якасці, рэдка трацілася некалькі гадоў і велізарныя колькасці зыходнага сыравіны. Нягледзячы на складанасць працэсу, да 1940-х гадоў у чыстым выглядзе было атрымана каля 20 бялкоў.
Метады ачысткі бялку пастаянна ўдасканальваюцца і дазваляюць атрымліваць больш чыстых лекаў у большай колькасці і за меншы час. Выкарыстоўваючы сучасныя метады, мы можам аддзяліць вавёркі, падобныя па сваіх уласцівасцях да некалькіх гадоў таму, як адно чыстае рэчыва [1].
Крыніца бялку
Культура рэкамбінантных бактэрый
Бялкі складаюць значную долю сухой масы ўсіх жывых арганізмаў, аднак канцэнтрацыя кожнага асобнага бялку можа істотна адрознівацца, напрыклад, гемаглабін значна перавышае ўсе астатнія злучэнні ў эрытрацытах, у той час як на клетку кішачнай палачкі можа быць толькі некалькі малекул рэпрэсатара. Звычайна адзін і той жа бялок можна вылучыць з розных крыніц, у прыватнасці, многія ферменты метабалізму ўласцівыя ўсім формам жыцця. Аднак уласцівасці бялкоў, атрыманых ад розных арганізмаў, а таксама з розных тканін аднаго і таго ж арганізма, могуць адрознівацца. Звычайна пры выбары крыніц для выдзялення і ачысткі бялку кіруюцца такімі крытэрыямі, як лёгкасць атрымання патрэбнай тканіны (клеткі) у дастатковай колькасці, канцэнтрацыя ў ёй патрэбнага злучэння, а таксама крытэрыі, характэрныя для кожнага бялку, якія могуць палепшыць яго вылучэнне і стабілізацыю. Часцей за ўсё выкарыстоўваюць тканіны хатніх (свіней, кароў, курэй) або лабараторных (пацукоў) жывёл, а таксама культуры мікраарганізмаў, такіх як кішачная палачка і дрожджы пекарні (Saccharomyces cerevisiae). Аднак, з развіццём і распаўсюджваннем метадаў малекулярнага кланавання, вавёркі ўсё часцей выводзяцца з мікраарганізмаў, якія выпрацоўваюць патрэбны ген. У гэтым выпадку клонированный бялок можа складаць каля 30% усяго бялковага пабочнага прадукту, што значна палягчае яго вылучэнне і ачыстку [2]. Ператварэнне бялкоў у раствор
Данс, шкляныя гомагенізатары з тэфлонавымі поршнямі
Пасля выбару крыніцы бялку на першым этапе ачышчэнне - гэта перанос яго ў раствор, гэты этап непатрэбны ў выпадку аддзялення бялкоў ад біялагічных вадкасцяў, напрыклад, плазмы крыві. Існуе мноства спосабаў разбурэння клеткавых мембран, каб вызваліць цытазол, і выбар аднаго залежыць ад механічных уласцівасцей крыніцы бялку, а таксама ад яго месцазнаходжання. Клеткі размяшчаюцца ў гіпатанічным асяроддзі, дзе з-за асматычных з'яў яны набракаюць і трэскаюцца. Гэты метад можа быць выкарыстаны для клетак жывёл, якія не маюць клеткавай сценкі, але для раслінных, бактэрыяльных і грыбковых ён у асноўным неэфектыўны. Клеткавая сценка бактэрый часта руйнуецца ферментам лизоцимом, таксама з дапамогай ультрагукавога даследавання (УГД). Мыйныя сродкі (Triton X-100, Tergitol NP-40 і г.д.) або арганічныя растваральнікі (ацэтон, талуол) часта выкарыстоўваюцца ў растворах для лізінгу, але гэта дапушчальна толькі тады, калі такія рэчывы не дэнатураваць патрэбны бялок.
Узоры клеткі і тканіны таксама можна гамагенізаваць пры дапамозе цыкла замарожвання / адтавання, шліфавання пяском або шклянымі шарыкамі, хуткаходных блендеров, гамагенізатараў (якія складаюцца з гільз і шчыльна прылягаюць шкла або тэфлонавых поршняў, механічных і ручных прэсаў) (клеткі руйнуюцца пры націсканні праз невялікае адтуліну пад высокім ціскам.). Атрыманы лізат фільтруюць або цэнтрафугуюць, каб адкласці вялікія фрагменты клетак. Калі патрэбны бялок лакалізуецца не ў цытазоле, а ў нейкай субклеточной фракцыі, напрыклад, плазматычнай мембране, ядры ці мітахондрыях, то яго ачышчэнне прадугледжвае вылучэнне гэтай фракцыі шляхам дыферэнцыяльнага цэнтрабежвання: спачатку вылучаюцца цяжкія клеткавыя кампаненты, затым выбіраюць супернатант і адбіраюць цэнтрыфугу. неабходная фракцыя пераходзіць у асадак. Мембранныя вавёркі аддзяляюцца ад ліпідаў мыйнымі сродкамі або арганічнымі растваральнікамі [2]. Стабілізацыя бялку - Пасля вывядзення бялку з натуральных умоў ён можа быць знішчаны многімі фактарамі. У прыватнасці, вавёркі дэнатураваны пры змене pH, таму растворы лізісу і наступныя этапы ачысткі ўтрымліваюць буферныя сістэмы, якія падтрымліваюць індэкс вадароду ў межах, у межах якога патрэбныя малекулы будуць заставацца стабільнымі.
Большасць бялкоў падвяргаюцца павольнай дэнатурацыі пры тэмпературы вышэй за 25 ° С. . З-за гэтага ўсе працэдуры з імі часцей за ўсё выконваюцца пры астуджэнні да 0-4 ° С (на лёдзе). Некаторыя вавёркі захоўваюць стабільнасць за межамі жывых клетак толькі пры тэмпературы ніжэй -100 ° С. З іншага боку, існуюць таксама адчувальныя да холаду вавёркі, якія нельга астудзіць.
Падчас лізісу клетак вылучаюцца пратэазы, ферменты, якія гідралізуюць вавёркі. Яны могуць выклікаць дэградацыю патрэбнага бялку. Хоць клеткавыя экстракты падтрымліваюць рН, пры якім такія ферменты неактыўныя, яны таксама пераважна выкарыстоўваюць хімічныя інгібітары пратэазы, такія як PMSF. Яшчэ адной патэнцыйнай прычынай дэградацыі бялку могуць быць мікраарганізмы, таму пры працяглым захоўванні ў бялковыя растворы дадаецца невялікая колькасць таксічных злучэнняў, якія не ўплываюць на структуру саміх бялкоў, напрыклад, азід натрыю. Шматлікія вавёркі могуць быць нестабільнымі на вадка-паветраным стыку. , а пры нізкай канцэнтрацыі вялікая частка іх малекул губляецца з-за сорбцыі на паверхнях. З-за гэтага падчас аддзялення бялкоў яны імкнуцца пазбегнуць адукацыі пены і бурбалак і трымаюць растворы канцэнтраванымі.
Калі патрэбны бялок асабліва ўстойлівы да любога з наступных фактараў, здольных разбурыць іншыя вавёркі, гэтую ўласцівасць можна выкарыстоўваць для ачысткі. Напрыклад, калі ён вельмі цеплатрывалы, экстракт клетак награваецца да высокай тэмпературы на працягу кароткага перыяду часу, у выніку чаго большая частка прымешак дэнатуіруецца і асядае, а неабходны бялок застаецца цэлым. Устойлівыя да протеаз вавёркі можна ізаляваць з дапамогай клеткавага аўталізу, гэта значыць для падтрымання лізату ва ўмовах, калі пратэялітычныя ферменты актыўныя і руйнуюць большасць іншых клеткавых бялкоў. [3]
Метады падзелу
br> Метады - Растваральнасць - Солінне - Напластаванне - Зарадка ў іянізаванай форме - Іонна-абменная храматаграфія - Электрафарэз - Ізаэлектрычнае факусаванне - Палярнасць - Адсарбцыйная храматаграфія
Храматаграфія на артыкулы
Зваротная фазавая храматаграфія - Гідрафобныя х раматаграфія - Памер малекул - Дыяліз і ультрафільтрацыя - Гель-электрафарэз - Гель-фільтрацыя - Ультрацэнтрыфугацыя - Спецыфічнасць звязвання - Хроматография аффинности
Адрозненні ў іх уласцівасцях могуць быць выкарыстаны для падзелу бялкоў напрыклад, зарад у іянізаванай форме, растваральнасць, малекулярная маса, палярнасць, здольнасць спецыфічна звязвацца з пэўнымі злучэннямі.
Заўвагі
↑ Voet et al., 2011, p. 132
Vo a b Voet і інш, 2011, с. 130
↑ Voet et al., 2011, с. 130-131 - Крыніцы - Берг Дж. М., Тымочка Ю. Л., Стрыер Л (2007). Біяхімія (т. 6-га). W.H. Фрыман і кампанія. р. 67—75. ISBN 0-7167-8724-5.
Нэльсан Д.Л., Кокс М.М. (2008). Прынцыпы біяхіміі Ленінгера (т. 5). У. Х. Фрыман. р. 85—92. ISBN 978-0-7167-7108-1.
Voet D., Voet J.G. (2011 г.). Біяхімія (т. 4). Вілі. р. 129—156. ISBN 978-0470-57095-1.


Очищення білків

Випадкові Статті

Предводитель дворянства

Предводитель дворянства

Предводитель дворянства — впродовж 1766—1917 — обраний на губернських і повітових дворянсь...
Ханнес Хювенен

Ханнес Хювенен

Ханнес Хювенен фін Hannes Hyvönen; 29 серпня 1975, м Оулу, Фінляндія — фінський хокеїст, правий...
Віньоле-Борбера

Віньоле-Борбера

Віньоле-Борбера у Вікісховищі Віньоле-Борбера італ Vignole Borbera, п'єм Vigneule — мун...
Андрій Валентинов

Андрій Валентинов

Висловлювання у Вікіцитатах Андрі́й Валенти́нов, справжнє ім'я Андрі́й Валенти́нович Шмалько...