Mon . 20 Aug 2020

Вектор (молекулярная биология)

В молекулярном клонировании вектор представляет собой молекулу ДНК, используемую в качестве носителя для искусственного переноса чужеродного генетического материала в другую клетку, где он может быть реплицирован и / или экспрессирован, например, плазмида, космида, лямбда-фаги. Вектор, содержащий чужеродную ДНК, называется рекомбинантной ДНК. Четырьмя основными типами векторов являются плазмиды, вирусные векторы, космиды и искусственные хромосомы. Из них наиболее часто используемыми векторами являются плазмиды [1] Общими для всех сконструированных векторов являются источник репликации, сайт мультиклонирования и селектируемый маркер < Сам вектор, как правило, представляет собой последовательность ДНК, которая состоит из трансгена вставки и большей последовательности, которая служит «основой» вектора. Цель вектора, который передает генетическую информацию в другую клетку, обычно состоит в том, чтобы изолировать, размножить или экспрессировать вставку в клетке-мишени. Все векторы могут быть использованы для клонирования и, следовательно, являются клонирующими векторами, но существуют также векторы, разработанные специально для клонирования, в то время как другие могут быть разработаны специально для клонирования. в частности, для других целей, таких как транскрипция и экспрессия белка. Векторы, сконструированные специально для экспрессии трансгена в клетке-мишени, называются экспрессирующими векторами и обычно имеют промоторную последовательность, которая управляет экспрессией трансгенных векторов Simpler, называемых векторами транскрипции, способны только транскрибируются, но не транслируются: они могут реплицироваться в клетке-мишени, но не экспрессироваться, в отличие от векторов экспрессии. Векторы транскрипции используются для усиления их вставки. Манипулирование ДНК обычно проводят на векторах E coli, которые содержат элементы, необходимые для их поддержание в E. coli Однако векторы могут также иметь элементы, которые позволяют им поддерживаться в другом организме, таком как клетки дрожжей, растений или млекопитающих, и эти векторы называются челночными векторами. Такие векторы имеют бактериальные или вирусные элементы, которые могут быть перенесены в другие клетки. -бактериальный организм-хозяин, однако были также разработаны другие векторы, называемые внутригенными векторами сбежал, чтобы избежать передачи какого-либо генетического материала от чужеродного вида [2]. Вставка вектора в клетку-мишень обычно называется трансформацией для бактериальных клеток, [3] трансфекцией для эукариотических клеток, [4], хотя вставка вирусный вектор часто называют трансдукцией [5]
Содержание
1 Характеристики
11 Плазмиды
12 Вирусные векторы
13 Искусственные хромосомы
2 Транскрипция
3 Экспрессия
31 Прокариот вектор экспрессии
32 Эукариоты вектор экспрессии
4 Особенности
5 См. также 6 Ссылки
7 Дополнительная литература
8 Внешние ссылки
Характеристики
Плазмиды
Основная статья Плазмидный вектор
Плазмиды представляют собой двухцепочечные и, как правило, кольцевые последовательности ДНК, которые способны реплицироваться с использованием механизма репликации клетки-хозяина. [6] Плазмидные векторы минималистически состоят из источника репликации, который позволяет полу-независимую репликацию плазмиды в Плазмиды-хозяева широко распространены во многих бактериях, например, в Escherichia c. oli, но также могут быть обнаружены у нескольких эукариот, например у дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae [7]. Бактериальные плазмиды могут быть конъюгированными / трансмиссивными и неконъюгативными: конъюгированные - опосредовать перенос ДНК посредством конъюгации и, следовательно, быстро распространяться среди бактериальные клетки популяции; например, плазмида F, многие R и некоторые col плазмиды - неконъюгативные - не опосредуют ДНК через конъюгацию, например, многие R и col плазмиды - плазмида pBR322 является одной из первых плазмид, широко используемых в качестве клонирующего вектора. > Плазмиды со специально сконструированными свойствами обычно используются в лаборатории для целей клонирования. Эти плазмиды, как правило, неконъюгативны, но могут иметь гораздо больше функций, в частности, «сайт множественного клонирования», где множественные сайты расщепления рестриктазой позволяют вставлять вставку трансгена. Бактерии, содержащие плазмиды, могут генерировать миллионы копий вектора внутри бактерий в течение нескольких часов, и амплифицированные векторы могут быть извлечены из бактерий для дальнейшей манипуляции. Плазмиды могут использоваться конкретно в качестве векторов транскрипции, и такие плазмиды могут не иметь решающих последовательностей для экспрессии белка. Плазмиды, используемые для экспрессии белка, называемые векторами экспрессии, будут включать элементы для трансляции белка, такие как сайт связывания рибосомы, запускать и останавливать кодоны
Вирусные векторы
Основная статья: Вирусный вектор
Вирусные векторы - это, как правило, генно-инженерные вирусы, несущие модифицированную вирусную ДНК или РНК, которые стали неинфекционными, но все же содержат вирусные промоторы, а также трансген, поэтому возможность трансляции трансгена через вирусный промотор. Однако поскольку вирусным векторам часто не хватает инфекционных последовательностей, им требуются вирусы-помощники или линии упаковки для крупномасштабной трансфекции. Вирусные векторы часто предназначены для постоянного включения вставки в геном хозяина, и таким образом, после включения трансгена оставляют различные генетические маркеры в геноме хозяина. Например, ретровирусы оставляют характерный образец интеграции ретровируса после вставки, который можно обнаружить и указывает на то, что вирусный вектор внедрился в геном хозяина
Искусственные хромосомы
Основная статья : Искусственные хромосомы неоднозначности
Искусственные хромосомы производятся хромосомы в контексте дрожжевых искусственных хромосом YAC, бактериальных искусственных хромосом BAC или искусственных хромосом человека HAC Искусственная хромосома может нести гораздо больший фрагмент ДНК, чем другие векторы [8] YAC и BAC могут нести фрагмент ДНК длиной до 300 000 нуклеотидов. Три структурных потребности искусственной хромосомы включают в себя происхождение репликации, центромеры и концевые последовательности теломер [9]
Транскрипция
Транскрипция клонированного гена является необходимым компонентом вектора, когда требуется экспрессия гена: один ген могут быть амплифицированы посредством транскрипции для генерации нескольких копий мРНК, матрица, на которой белок может быть получен путем трансляции [10] Большее количество мРНК будет экспрессировать большее количество белка, и сколько генерируемых копий мРНК зависит от промотора используется в векторе [11] Выражение может быть конститутивным, что означает, что белок постоянно продуцируется в фоновом режиме, или оно может быть индуцируемым, посредством белок экспрессируется только при определенных условиях, например, при добавлении химического индуктора. Эти два различных типа экспрессии зависят от используемых типов промотора и оператора. Вирусные промоторы часто используются для конститутивной экспрессии в плазмидах и вирусных векторах, поскольку они обычно вызывают постоянную транскрипцию во многих клеточных линиях и типах надежно [12]. Индуцируемая экспрессия зависит от промоторов, которые реагируют на условия индукции: например, промотор вируса опухоли молочной железы мыши инициирует транскрипцию только после применения дексаметазона, а промотор теплового шока дрозофилии только инициирует после высоких температур
Некоторые векторы предназначены только для транскрипции, например, для производства мРНК in vitro. Эти векторы называются векторами транскрипции. У них может отсутствовать последовательность, необходимая для полиаденилирования и терминации, поэтому они не могут использоваться для производства белка
Экспрессия
Основная статья: Вектор экспрессии
Производят векторы экспрессии белки посредством транскрипции вставки вектора с последующей трансляцией полученной мРНК, поэтому они требуют большего количества компонентов, чем более простые векторы только для транскрипции. Для экспрессии в разных организмах-хозяевах потребуются разные элементы, хотя они имеют общие требования, например, промотор для инициации транскрипции, рибосомного сайта связывания для инициации трансляции и сигналов терминации
Вектор экспрессии прокариот
Промотор - обычно используемые индуцибельные промоторы - это промоторы, происходящие из lac-оперона и промотора T7. Другие сильные промоторы, которые используются, включают промотор Trp и Tac-промотор , которые являются гибридом как промоторов Trp, так и Lac Operon. Сайт связывания рибосомы RBS - следует за промотором и способствует эффективной трансляции интересующего белка. Сайт инициации трансляции - последовательность Шайна-Дальгарно, заключенная в RBS, 8 пар оснований выше стартового кодона AUG
вектор экспрессии эукариот
вектор экспрессии эукариот ors требуются последовательности, которые кодируют:
Хвост полиаденилирования: создает хвост полиаденилирования в конце транскрибированной пре-мРНК, который защищает мРНК от экзонуклеаз и обеспечивает завершение транскрипции и трансляции: стабилизирует продукцию мРНК
Минимальная длина UTR: UTRs содержат специфические характеристики, которые могут препятствовать транскрипции или трансляции, и, следовательно, самые короткие UTR или вообще не кодируются для оптимальных векторов экспрессии
последовательности Козака: векторы должны кодировать последовательность Козака в мРНК, которая собирает рибосому для трансляции мРНК
Особенности
Современные искусственно сконструированные векторы содержат важные компоненты, присутствующие во всех векторах, и могут содержать другие дополнительные функции, обнаруженные только в некоторых векторах:
Происхождение репликации: необходимо для репликации и поддержания вектора в клетке-хозяине
Промотор: Промоторы используются для управления транскрипцией трансгена вектора, а также других генов в векторе, таких как ген устойчивости к антибиотикам. Некоторые клонирующие векторы не обязательно должны иметь промотор для клонированной вставки, но он является важным компонентом экспрессирующих векторов, так что клонированный продукт может быть экспрессирован. Сайт клонирования: это может быть сайт множественного клонирования или другие признаки, которые позволяют вставлять чужеродную ДНК в вектор посредством лигирования
Генетические маркеры: генетические маркеры для вирусных векторов позволяют подтвердить, что вектор интегрирован с геномной ДНК хозяина
Устойчивость к антибиотикам: векторы с устойчивостью к антибиотикам открывают рамки считывания позволяют выживать клеткам, которые захватили вектор в ростовой среде, содержащей антибиотики, путем отбора антибиотиков. Эпитоп: некоторые векторы могут содержать последовательность для конкретного эпитопа, который может быть включен в экспрессированный белок. Это позволяет идентифицировать антитела клеток, экспрессирующих целевой белок
репортерные гены: некоторые векторы могут содержать репортерный ген, который позволяет идентифицировать плазмиду, которая содержит Вставленная последовательность ДНК. Примером является lacZ-α, который кодирует N-концевой фрагмент β-галактозидазы, фермента, который расщепляет галактозу. Сайт множественного клонирования расположен внутри lacZ-α, и вставка, успешно лигированная в вектор, нарушит последовательность гена, приводящая к неактивной β-галактозидазе Клетки, содержащие вектор со вставкой, могут быть идентифицированы с использованием сине-белого отбора путем выращивания клеток в среде, содержащей аналог X-gal галактозы. Клетки, экспрессирующие β-галактозидазу, следовательно, не содержат вставки, появляются в качестве синих колоний Белые колонии будут выбраны в качестве колоний, которые могут содержать вставку. Другие обычно используемые репортеры включают зеленый флуоресцентный белок и люциферазу. Последовательность нацеливания: векторы экспрессии могут включать кодирование последовательности нацеливания в готовом белке, которая направляет экспрессированный белок к определенная органелла в клетке или определенное место, такое как периплазматическое пространство бактерий. Теги очистки белка: некоторые expr Векторы экспрессии включают белки или пептидные последовательности, которые обеспечивают более легкую очистку экспрессированного белка. Примеры включают полигистидин-метку, глутатион-S-трансферазу и мальтозосвязывающий белок. Некоторые из этих меток могут также обеспечивать повышенную растворимость целевого белка. слитый с белковой меткой, но сайт расщепления протеазой, расположенный в области полипептидного линкера между белком и меткой, позволяет удалить метку позже
Смотрите также
Плазмида
Вирусный вектор
Вектор клонирования
Вектор экспрессии
Гибридный вектор
Мини-круг
Рекомбинантная ДНК
Голая ДНК - Векторная эпидемиология, организм, передающий болезнь
Искусственные хромосомы человека
Искусственные хромосомы дрожжей
Бактериальные искусственные хромосомы


^ Lodish H., Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J 2000 "Клонирование ДНК с помощью плазмидных векторов" Молекулярная клеточная биология, 4-е издание, Нью-Йорк: WH Freeman
^ Acquaah G 16 августа 2012 Принципы П Джент Уайли & amp; Sons Inc ISBN 978-1-118-31369-5
^ Джонстон С., Мартин Б., Фичант Г., Полард П., Клеверс Дж. П. Март 2014 г. «Бактериальная трансформация: распределение, общие механизмы и расходящийся контроль» Обзоры природы Микробиология 12 3: 181–96 doi: 101038 / nrmicro3199 PMID 24509783
^ «MeSH Browser» meshbnlmnihgov Получено 2018-04-16
^ Хартл Д.Л., Джонс Е.В. 1998 Генетика: принципы и анализ 4-е изд. Садбери, Масса: Джонс и Бартлетт Издатели ISBN 978-0-7637-0489-6 OCLC 45730915
^ del Solar, Gloria; Хиральдо, Рафаэль; Руис-Эчеваррия, Мария Хесус; Эспиноза, Мануэль; Диас-Орехас, Рамон, июнь 1998 г. «Репликация и контроль циркулярных бактериальных плазмид» Обзоры микробиологии и молекулярной биологии 62 2: 434–464 ISSN 1092-2172 PMC 98921 PMID 9618448
^ Brown TA 2010 "Глава 2 - Векторы для клонирования генов : Плазмиды и бактериофаги »Клонирование генов и анализ ДНК: введение 6-е издание Wiley-Blackwell ISBN 978-1-4051-8173-0
^ Джулин, Дуглас 2014 Молекулярные науки о жизни Springer, Нью-Йорк, Нью-Йорк, стр. 1–3 дои : 101007 / 978-1-4614-6436-5_91-3
^ Мюррей, Эндрю; Шостак, Джек, ноябрь 1987 г. «Искусственные хромосомы», Scientific American 257 5: 62–68
^ Соломон Е.П., Берг Л.Р., Мартин Д.В. 2005 г. Биология, 8-е издание, Белмонт, Калифорния: Брукс / Коул Томсон, Изучение ISBN 978-0-495-31714 -2 OCLC 123008833
^ Дамдиндорж Л., Карнан С., Ота А., Хоссейн Е., Кониши Ю., Хосокава Ю., Кониши Г. 2014-08-29 «Сравнительный анализ конститутивных промоторов, расположенных в адено-ассоциированных вирусных векторах» PLOS One 9 8: e106472 doi: 101371 / journalpone0106472 PMC 4149579 PMID 25170953
^ Левин А., Майер М., Хусаинов Дж, Джейкоб Д., Аппель Б, июнь 2005 г. «Вирусные промоторы могут инициировать экспрессию генов токсинов, введенных в Escherichia coli» BMC Biotechnology 5 : 19 doi: 101186 / 1472-6750-5-19 PMC 1181807 PMID 15967027
Дальнейшее чтение
Freshney IR Культура клеток животных: руководство по базовой технике Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & amp; Sons, Inc ISBN 978-0-471-45329-1
Внешние ссылки
Waksman Scholars введение в векторы
Сравнение векторов, используемых для клинического переноса генов
Блок транспорта генов
Молекулярная и Портал клеточной биологии


Vector (molecular biology)

Random Posts

B♭ (musical note)

B♭ (musical note)

B♭ B-flat; also called si bémol is the eleventh step of the Western chromatic scale starting from C ...
Fourth dimension in art

Fourth dimension in art

New possibilities opened up by the concept of four-dimensional space and difficulties involved in tr...
Holt Renfrew

Holt Renfrew

Holt, Renfrew & Co, Limited, commonly known as Holt Renfrew or Holt's,1 is a chain of high-end C...
Later Silla

Later Silla

Later Silla 668–935, Hangul: 후신라; Hanja: 後新羅; RR: Hushila, Korean pronunciation: ...